دانلود پایان نامه استاندارد و مشاهده

ارلن دهانه گشاد ml 100
اسلایدهای شیشه‌ای
اتانل 96%
رنگ کریستال ویوله
روش کار:
ابتدا باکتری‌های جدا شده از بیوفیلم را فعال کرده، به این صورت که یک لوپ از کلنی باکتری مورد نظر بر روی محیط کشت جامد را به یک لوله‌ی حاوی 3 میلی‌لیتر محیط تریپتیکاز سوی براث استریل تلقیح کرده و سپس به مدت 18 تا 20 ساعت این محیط را در دمای (C30 انکوبه می‌کنیم. بعد از گذشت این زمان، یک میلی‌لیتر از این محیط را در شرایط استریل برداشته و به کدورت معادل 5/0 مک‌فارلند می‌رسانیم(با اضافه کردن به محیط استریل در یک لوله‌ی دیگر). سپس به یک ارلن(ml 100) 50 میلی‌لیتر محیط TSB اضافه کرده و دو اسلاید شیشه‌ای که با اتانل 96% تمیز و ضد عفونی شده‌اند درون ارلن قرار داده می‌شود و بعد از پنبه‌گذاری درب ارلن، اتوکلاو آن صورت می‌گیرد. بعد از اتوکلاو و سرد شدن ارلن‌ها‌، نوبت به تلقیح آنها توسط سوسپانسیون میکروبی می‌رسد. برای این منظور 1 میلی‌لیتر از سوسپانسیون میکروبی معادل استاندارد 5/0 مک‌فارلند در شرایط استریل به ارلن‌ها اضافه شد. سپس ارلن‌ها در دمای آزمایشگاه و روی شیکر با دور rpm 100 قرار داده شدند. در نهایت، بعد از گذشت مدت زمان‌های 4، 8، 16 و 20 ساعت اسلاید‌های شیشه‌ای از یک ارلن خارج شدند و یک اسلاید برای رنگ‌آمیزی با کریستال ویوله و اسلاید دیگر برای شمارش و شناسایی باکتری‌های مورد نظر متصل به اسلاید به کار رفت.
2-8-1-1- روش رنگ‌آمیزی اسلایدهای شیشه‌ای
بعد از این که اسلاید شیشه‌ای از ارلن خارج شد به خوبی با آب مقطر استریل به منظور حذف سلول‌های پلانکتونیک از سطح اسلاید و یا سلول‌هایی که اتصالات ضعیفی با اسلاید دارند شسته شد. سپس رنگ‌آمیزی اسلاید توسط کریستال ویوله‌ی 2% به مدت 5 دقیقه صورت گرفت و بعد از گذشت این زمان اسلایدها شسته شدند و بعد از خشک شدن در دمای آزمایشگاه، با میکروسکوپ نوری مشاهده شدند.
به منظور ردیابی باکتری‌ها در تشکیل بیوفیلم، با کمک میکروسکوپ نوری بعد از گذشت مدت زمان‌های متفاوت، اسلایدها باید رنگ‌آمیزی شوند زیرا باکتری‌های متصل به سطح اسلاید توسط رنگ کریستال ویوله رنگ شده و می‌توان در زیر میکروسکوپ نوری آنها را مشاهده کرد.
2-8-1-2- روش شمارش و شناسایی باکتری‌های متصل به سطح اسلاید
برای مشخص شدن این که کدام باکتری زودتر به سطح متصل می‌شود و نسبت به بقیه‌ی باکتری‌های موجود در سوسپانسیون میکروبی توانایی بالاتری در تشکیل بیوفیلم دارد و همچنین تعیین تراکم و تعداد سلول‌ها در بیوفیلم و تغییرات آن با گذشت زمان نیاز به شناسایی و شمارش باکتری‌های سطح اسلاید می‌باشد.
مراحل انجام آزمایش:
برای این کار، بعد از بیرون آوردن اسلاید شیشه‌ای از درون ارلن، به خوبی با آب مقطر استریل شسته شده و سپس توسط یک سواپ استریل، سطح مشخصی از آن که دارای بیوفیلم می‌باشد را برداشته و سپس سواپ را در 9 میلی‌لیتر آب مقطر استریل به شدت تکان داده تا باکتری‌های متصل شده به سر سواپ در آب مقطر رها شوند. سپس لوله‌ی مورد نظر را به مدت 1 دقیقه به منظور پراکندگی یکسان باکتری‌ها در آب مقطر، ورتکس کرده و در نهایت برای آزمایش شمارش و شناسایی به کار می‌رود. این آزمایش توسط روش drop plate صورت گرفت(40).