دانلود پایان نامه فیزیولوژی و استاندارد

دانلود پایان نامه فیزیولوژی و استاندارد


Widget not in any sidebars

مواد و سایل لازم برای انجام این آزمایش همانند آزمایش MATH می‌باشد.
روش انجام آزمایش:
در این روش به میکروارگانیسم‌های یک سویه اجازه داده می‌شود که به قطرات هیدروکربن متصل شوند. سپس این قطرات هیدروکربن برای آزمایش MATH با سویه‌ی دیگر مورد استفاده قرار می‌گیرند. روش انجام به این صورت است که بعد از تهیه‌ی کشت 24 ساعته از باکتری Micrococcus loteus و سایر باکتری‌ها، این محیط‌ها برای تهیه‌ی سوسپانسیون سلولی در فسفات بافر سالین سانتریفوژ شدند. سپس از سوسپانسیون باکتری میکروکوکوس لوتئوس 5/3 میلی‌لیتر به یک لوله‌ی کووت اضافه شد و بعد 5/0 میلی‌لیتر هیدروکربن به لوله اضافه شد. بعد این لوله به مدت 2 دقیقه در دور متوسط ورتکس گردید و در نهایت در یک محل برای جدا شدن دو فاز آبی و آلی، لوله به صورت ساکن قرار گرفت. بعد از جدا شدن این دو فاز با یک سمپلر که روی 500 میکرولیتر تنظیم شده است قطرات هیدروکربن در فاز آلی که سلول‌های باکتری Micrococcus loteus به آنها متصل شده است، برداشته شدند و برای آزمایش MATH دوم با سویه‌ی دیگر به کار رفتند. این مراحل برای تمام باکتری‌های ایزوله شده انجام شد و در نهایت درصد سلول‌های خارج شده از فاز آبی محاسبه شد.
2-7- روش‌ به کار رفته برای سنجش هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌های موجود در بیوفیلم
برای مقایسه‌ی تغییرات ایجاد شده در سطح سلول‌های موجود در بیوفیلم با سلول‌های پلانکتونیک، آزمایش MATH نیز برای سلول‌های موجود در بیوفیلم صورت گرفت. علاوه بر این مقایسه، می‌‌توان دریافت که تغییرات هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌ها در بیوفیلم، ناشی از تغییرات فیزیولوژیکی ایجاد شده در سلول و یا نتیجه‌ی تولید پلی ساکارید در بیوفیلم می‌باشد، زیرا تولید پلی ساکارید در بیوفیلم سبب کاهش شدید هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌ها می‌شود.
به طور کلی، می‌توان گفت که تغییرات فنوتیپی اساسی در سلول‌های بیوفیلم نیز به نوبه‌ی خود می‌تواند هیدروفوبیسیتی سطح سلول‌ها را تغییر بدهد. در این تست سلول‌های بیوفیلم شسته می‌شوند تا دلایل تغییرات هیدروفوبیسیتی مشخص شوند که متعاقباً توضیح داده می‌شود(10، 80).
2-7-1- روش MATH برای سلول‌های موجود در بیوفیلم
برای انجام این آزمایش باید ابتدا بیوفیلم باکتری‌های جداسازی شده، تشکیل شود که این مورد توسط تست لوله‌ای صورت گرفت.
2-7- 1-1- روش تست لوله‌ای برای سلول‌های موجود در بیوفیلم
مواد و وسایل لازم:
لوله‌های شیشه‌ای با اندازه‌ی nm 100*13
محیط TSB
پیپت
بافر PBS
روش انجام آزمایش:
در این تست، لوله‌های شیشه‌ای حاوی 3 میلی‌لیتر محیط تریپتیکاز سوی براث با یک لوپ پر از کلنی باکتری های جداسازی شده ، تلقیح می‌شوند.
سپس این لوله‌ها در دمای (C30 به مدت 24 ساعت روی شیکر با دور rpm 100 قرار می‌گیرند. بعد از گذشت این زمان، محتویات لوله‌ها به آرامی توسط یک پیپت خارج شده و هر لوله یک بار با فسفات بافر سالین شسته می‌شود. به این صورت که 3 میلی‌لیتر بافر به لوله اضافه کرده و دو بار با پیپت خارج می‌شود. سپس دوباره 3 میلی‌لیتر بافر به لوله‌ها اضافه شده و لوله به مدت 2 دقیقه ورتکس می‌شود. عمل ورتکس کردن سبب می‌شود که بیوفیلم متصل به دیواره‌ی لوله‌ها تخریب و سلول‌ها در بافر فسفات سالین آزاد شوند.
2-7-1-2- روش انجام آزمایش MATH برای سلول‌های موجود در بیوفیلم
سوسپانسیون به دست آمده از تست لوله‌ای حاوی سلول‌های بیوفیلم می‌باشد. برای شستشوی این سلول‌ها سانتریفوژ این سوسپانسیون در دور rpm 3000 و به مدت 15 دقیقه صورت می‌گیرد. سپس محلول رویی دور ریخته شده و رسوب سلول‌ها در ته لوله دوباره در بافر حل می‌شود. این عمل 3 مرتبه تکرار می‌شود تا سلول‌ها به خوبی شسته شوند و پلی‌ساکارید خارج سلولی تا حد امکان حذف شود. پس بعد از آخرین مرحله‌ی شستشو، یک سوسپانسیون معادل استاندارد نیم مک‌فارلند از سلول‌های رسوب یافته تهیه می‌شود و در نهایت همانند آزمایش‌های قبلی، تست MATH برای تعیین هیدروفوبیسیتی سطح سلول ها انجام می‌شود.
2- 8- روش‌های به کار رفته در ارزیابی قدرت اتصال هر یک از باکتری‌ها به سطوح و بررسی ساختار بیوفیلم
2-8-1- روش تشکیل بیوفیلم روی اسلایدهای شیشه‌ای به منظور ردیابی تشکیل بیوفیلم
در این آزمایش، اتصال باکتری‌ها به لام شیشه‌ای که در مخلوط باکتری‌ها قرار گرفته است مورد بررسی قرار می‌گیرد. البته باید ذکر شود که شیشه دارای خاصیت هیدروفوبی کمتری نسبت به هیدروکربن می باشد و باید نتایج حاصل از این آزمایش با آزمایش MATH مقایسه شوند. هدف این آزمایش مشخص کردن این که کدام یک از باکتری‌ها زودتر به سطح لام متصل می‌شوند و در تشکیل بیوفیلم جزء اولین‌ها هستند، می‌باشد. همچنین با استفاده از این روش و روش بعدی که توضیح داده می شود می‌توان باکتری‌هایی را که هیچ نقشی در تشکیل بیوفیلم ندارند را نیز شناسایی کرد(10).
مواد و وسایل لازم:
محیط کشت TSA و TSB

مدیر سایت