مقاله رایگان درمورد ارزیابی توان و نگهداری

Copy space. New arrows painted on asphalt.

Widget not in any sidebars
3-2-1 رنگآمیزیگرم
این روش رنگآمیزی یک روش متداول در میکروبیولوژی است که در سال 1880 توسط یک پاتولوژیست دانمارکی به نام کریستینگرم ابداع شد. براساس این رنگآمیزی باکتریها را به دو دسته گرممثبت و گرممنفی تقسیم مینمایند. تصور میشود که این اختلاف در رنگآمیزی باکتریها مربوط به تفاوتهای دیوارهسلولی و پوششسلولی آنها باشد که موجب میشود باکتری گرممثبت بعد از رنگآمیزی به صورت ارغوانی تا بنفش دیده شوند در حالی که باکتری گرممنفی به رنگ قرمز مشاهده شوند. ابتدا از کلنی باکتری موردنظر، روی لام گسترهای تهیه کرده و گستره را خشک و سپس فیکس کردیم، سپس روی آن رنگ کریستالویوله ریخته و بعد از یک دقیقه رنگ را خالی کرده و لام شسته شد، بعد از آن روی گستره محلول لوگل ریخته و بعد از گذشت زمان یک دقیقه و تشکیل کمپلکس کریستالویوله-لوگل، عمل رنگبری به مدت 20-10 ثانیه با مخلوط الکل-استون انجام شد و سپس لام شسته شد. مرحله بعد معرفرنگیسافرانین را اضافه کرده و بعداز 30 تا 60 ثانیه رنگ را خالی کرده و گسترش با آب شسته شد و پس از رنگآمیزی در زیر میکروسکوپنوری با لنز 100 و به کمک روغن امرسیون اسلایدها مشاهده گردید.
3-2-2 تست کاتالاز
اکثر باکتریهای هوازی و بیهوازی، آنزیمی به نام کاتالاز دارند که قادر است ترکیبات سمی نظیر پراکسیدهیدروژن را که در اثر متابولیسم و تنفس باکتریها ایجاد میشود، تجزیه کند. برای انجام این تست بهتر است از کشتهای 24 ساعته استفاده شود.آباکسیژنه مصرفی باید تازه باشد و در صورت امکان از لوپ سیمی استفاده نشود زیرا که آباکسیژنه یک ماده اکسیدکننده است و بهتر است جنس لوپ از نیکروم باشد. یک قطره آباکسیژنه 3 درصد را روی لام قرار داده و مقداری از کلنی باکتری را داخل آن فرو برده و در صورتی که حبابهای اکسیژن آزاد شود باکتری کاتالازمثبت است. چون بعضی از باکتریها، کاتالاز ضعیفی دارند، در صورتی که مشکوک به جواب تست بودید بهتر است که داخل لوپ را نیز بررسی نمایید.
3-2-3 تست سیتوکروماکسیداز
اساس این تست وجود آنزیم سیتوکروماکسیداز یا کسیداز است که در باکتریهایی که از اکسیژن به عنوان گیرنده نهایی الکترون استفاده میکنند، وجود دارد. اکثر باکتریهای هوازی و بعضی از بیهوازیهای اختیاری این آنزیم را دارند. برای انجام تست اکسیداز از معرف دی یا تترامتیلپارافنیلندیآمین استفاده میشود. این معرف باید تازه تهیه شده ودر شیشههای تیره نگهداری شود چون در حضور نور اکسید میشود علاوه بر این کلنی مورد آزمایش نیز باید تازه باشد و از محیطهای قندی یا اختصاصی تهیه نشده باشد. در این تست یک کاغذصافی را روی لام قرار داده و سپس کلنی تازه را روی کاغذ قرار میدهیم و 2 تا 3 قطره از معرفاکسیداز به آن اضافه کرده و از آنجایی که در کمتر از یک دقیقه (10 ثانیه) رنگ کلنی آبی – بنفش شد، تست مثبت در نظر گرفته میشود.
3-2-4 تست کوآگولاز
در این تست هدف ردیابی یک سری از گونههای استافیلوکوکوک است که قادرند پلاسمای خون را لخته کنند. از آنجایی که این خاصیت نشاندهنده استافیلوکوکهای بیماری زا مثل استافیلوکوکاورئوس است بنابر این یک تست بسیار مفید جهت افتراق این دسته از استافیلوکوکها از سایرین است. برای انجام این آزمایش از دو روش استفاده میشود. سوبسترای این آزمایش پلاسمای سیتراته خرگوش بوده و قابلیت ایجاد لخته را دارد.
روش لولهای : در این روش برای انجام آزمایش یک میلیلیتر از پلاسمای سیتراته، در داخل یک لوله آزمایش کوچک ریخته شد. سپس یک کلنی از کشت تازه باکتری (18 تا 24 ساعت) به داخل لوله منتقل شد و به مدت 4 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه گشت. اگر باکتری کواگولازمثبت باشد طی 1 تا 4 ساعت لخته ایجاد میشود.
روش اسلایدی : در این روش یک قطره از پلاسمای سیتراته روی لام قرار داده شد و یک کلنی از باکتری تازه کشت داده شده در داخل این قطره حل شد. اگر باکتری کواگولازمثبت باشد طی 10 تا 20 ثانیه ایجاد لخته میکند.
3-2-5 تست حرکت
سادهترین روش برای بررسی تست حرکت باکتریها، گسترش مرطوب (Wet Mount) و قطرهمعلق (Hanging Drop) است. در روش اول یک سوسپانسیون از باکتری تهیه کرده و روی آن یک لامر قرار داده و با عدسی 10 یا 40 حرکت باکتری را بررسی مینماییم. در روش دوم روی یک لامل یک سوسپانسیون باکتری تهیه کرده، یک لام ته گرد برداشته و در اطراف گودی لام چند قطره بسیار کوچک روغن قرار داده و لام را به صورتی که قسمت گودی آن روی سوسپانسیون قرار گیرد روی لامر میگذاریم، سپس لام و لامر را برگردانده طوری که یک قطره سوسپانسیون بین لام و لامر معلق شود آن گاه حرکت باکتری را با عدسی 10 و یا 40 بررسی مینماییم.
3-2-6 هیدرولیز ژلاتین
بعضی از میکروبها قادرند جهت تجزیه و استفاده از ژلاتین، آنزیم ژلاتیناز تولید کنند که جهت ارزیابی توانایی تولید ژلاتیناز توسط میکروارگانیسم این تست انجام میشود. در این آزمایش، باکتری را در محیط نوترینت حاوی کاغذژلاتین تلقیح کرده و به مدت24، 48 و 72 ساعت در دمای 37 درجه سانتیگراد انکوبه میکنیم و پس از این دوره زمانی ژلاتین مایع شده را به مدت 20 دقیقه دریخچال قرار داده میشود، باقی ماندن حالت مایع در یخچال نشاندهنده تست مثبت و جامدشدن محیط ژلاتین بیانگر تست منفی است.
3-2-7 تست سیمونسیترات
سیترات به عنوان یک منبع کربن توسط بعضی از باکتریها مصرف میشود. باکتری به کمک آنزیم سیتراتاز، سیترات موجود را به اسیدهای ضعیفی نظیر اسیداستیک و اسیداگزالیک تبدیل نموده که ا
ینها در چرخه کربس مورد مصرف قرار گرفته و CO2 ایجاد میشود. CO2 حاصل با H2O وNa+ موجود در محیط واکنش داده و کربناتسدیم قلیایی ایجاد میکند، این ترکیب محیط را قلیایی کرده و رنگ آن را از سبز به آبی تغییر میدهد. برای بررسی توانایی تولید سیتراتاز توسط باکتریها مقداری از کلنی باکتری را روی سطح محیطکشت به صورت خطی کشت میدهند و پس از 24-18 ساعت نتیجه را بررسی مینمایند در صورتی که رنگ محیط از سبز به آبی تغییر کند نتیجه آزمون مثبت است.
3-2-8 تستMR/VP
آزمایش متیلرد میزان تولید اسید را از نظر کمی نشان می دهد. خانواده انتروباکتریاسه ممکن است در اثر تخمیر گلوکوز از مسیر اسیدهای مخلوط در فازهای زمانی اولیه انکوباسیون، اسیدهای قوی تولید نمایند که رنگ متیلرد را قرمز مینمایند. برای انجام این تست میکروارگانیسمهای مورد نظر را به محیط MR/VP تلقیح کرده و به مدت 24 تا 48 ساعت در دمای 35 درجه سانتیگراد انکوبه میکنیم و سپس 5 قطره معرف متیلرد افزوده که ظهور رنگ قرمز سطحی نشاندهنده مثبت بودن تست MR است. برای انجام تست VP به محیط هیدروکسیدپتاسیم 40 درصد و آلفانفتول اضافه کرده و به مدت 30 ثانیه آن را تکان داده و نتیجه را بعد از 15 دقیقه گزارش میکنیم که تشکیل حلقه قرمز در سطح محیط نشاندهنده مثبت بودن تستVP است.
3-2-9 تست هیدرولیز نشاسته
برخی از باکتریها به علت داشتن آنزیم آمیلاز قادرند نشاسته را تجزیه کنند. بنابر این باکتریها را به صورت خطی بر روی پلیت حاوی محیط نشاسته کشت داده و در دمای 37 درجه سانتیگراد به مدت 24 ساعت انکوبه گردید که پس از گذشت زمان مذکور چند قطره لوگل را بر روی نواحی رشد یافته ریخته و مشاهده هالهی شفاف اطراف کلنی نشانگر مصرف نشاسته توسط باکتری است و جواب تست مثبت میباشد.
3-2-10 تست هیدرولیز کازئین
برخی از باکتریها با تولید آنزیم کازئیناز، کازئین موجود در شیر را تجزیه میکنند. در این تست باکتریها را به صورت خطی بر روی محیط Skim Milk Agar کشت داده و به مدت 24 ساعت در دمای 37 درجهسانتیگراد انکوبه گردیدند. بعد از پایان انکوباسیون، وجود هاله شفاف در اطراف خط کشت نشانگر مصرف کازئین بوده و جواب تست مثبت میباشد.
3-3 شناسایی مولکولی باکتریهای اندوفتیک
در این مرحله 4 باکتریی که بیشترین اثر ممانعتی را از خود نشان دادند به روش مولکولی و با استفاده از تکنیک PCR شناسایی شدند.