مقاله رایگان درمورد نگهداری و سانتریفیوژ


Widget not in any sidebars

3-3-1 مواد و وسایل مورد استفاده جهت استخراج DNA
– کیت استخراج DNA از شرکت سیناژن با Cat.No.DN8115C که در شکل (3-1)آورده شده است
– میکروتیوبهای ۰/۵ و ۱/۵ و سرسمپلرهای 1۰0-10 و 10۰0- 100
– دستگاه میکروسانتریفیوژ با دور بالا، دستگاه ورتکس، بایواسپکتوفتومتر برای تعیین مقدار DNA، Dry plate با دمای بین ۱۰0 – ۲0 درجه سانتی‌گراد
– فریزر -۲۰ درجه سانتی‌گراد برای نگهداری DNA
شکل(3-1).کیت استخراج DNA شرکت سیناژن
3-3-2 روش استخراج DNA ژنومی
استخراج DNAهای ژنومی باکتری‌های ایزوله شده با استفاده از کیت استخراج DNAسیناژن به شرح زیر صورت گرفت:
– به نمونه باکتریهای ایزوله شده 100 مایکرولیتر Protease buffer اضافه نموده و نمونه‌ها به مدت 10 دقیقه در دمای 95 درجه سانتی‌گراد قرار داده شدند.
– 400 مایکرولیتر Lysis solution را به میکروتیوب حاوی نمونه اضافه و 20-15 ثانیه نمونه‌ها ورتکس گردیدند.
– 300 مایکرولیترPrecipititation solution را به میکروتیوب حاوی نمونه اضافه و 10 بار Inversion انجام داده و سپس نمونه‌ها در دمای 20- درجه سانتی‌گراد به مدت 20 دقیقه قرار داده شدند.
– میکروتیوب‌ها را به آرامی معکوس نموده و آب رویی را خالی نموده و رسوب برای مراحل بعد مورد استفاده قرار گرفت.
– 1000 مایکرولیترWash buffer به میکروتیوب حاوی نمونه اضافه و 10 بار Inversion انجام داده و نمونهها به مدت 5 دقیقه در rpm۱۴۰۰سانتریفوژ گردیدند.
– نمونهها را به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتیگراد قرار داده تا کاملا خشک شود.
– Solvent buffer به میکروتیوب حاوی نمونه اضافه و به آهستگی آن را Shakeنموده و به مدت 5 دقیقه در دمای 65 درجه سانتی‌گراد قرار داده شد.
– نمونه‌ها به مدت 30 ثانیه درrpm۱۲۰۰ سانتریفوژ گردیدند. در این مرحله محلول رویی شامل DNA خالص است.
3-3-3 روش تهیه ژل آگارز یکدرصد
قبل از از تهیه ژل، سینی مخصوص ژل را آماده کرده و شانه مخصوص در سینی قرار داده میشود. فاصله شانه تا کف سینی معمولاً 5/0 تا 1 میلیمتر در نظر گرفته میشود. مقدار 4/0 گرم پودرآگارز را در 40 میلیلیتر بافر TBE حل کرده و روی شعله ملایم حرارت داده تا شفاف شود. حین حرارت دادن مخلوط را هم زده تا پودرآگارز رسوب نکند و نسوزد. بافر TBE از تریس، بوریکاسید و EDTA تشکیل شده است. این بافر برای تنظیم pH محیط بکار میرود و غلظت آن در ژل و هم در تانک الکتروفورز باید یکسان باشد تا حین برقراری جریان الکتریکی، تعادلیونی بین یون و بافر تانک ایجاد شده و اختلالی در حرکت نمونه DNA رخ ندهد .بعد از شفافشدن ژل، آن را از روی شعله برداشته و وقتی دمای آن به 60-50 درجهسانتیگراد رسید، یک میکرولیتر ایتیدیومبروماید به آن اضافه کرده و به صورت هشت انگلیسی مخلوط شود، سپس مخلوط حاصل را سریعاً به داخل سینی مخصوص ژل منتقل کرده تا ژل در ظرف شکل بگیرد (ریختن ژل در ظرف باید آهسته و یکنواخت باشد تا حباب در ژل ایجاد نشود).
3-3-4 انجام PCR
تمامی مواد واکنش PCR از شرکت سیناژن تهیه شد و PCR براساس روشهای Gerhardt(1994) و Joseph و David (2007) انجام شد.
3-3-4-1 وسایل مورد استفاده برای انجام PCR و شرایط دمایی دستگاه ترموسایکلر
همان طور که در جدول (3-1) نشان داده شده است آزمایشPCR در مخلوط واکنشی به حجم 50 میکرولیتر شامل : 3/36 میکرولیتر ddH2O، 5 میکرولیتر10X buffer، 5/1 میلیمولارMgcl2، 2/0 میلیمولارdNTP، 25/0 میکرومولار Primerجدول (3-3)، 5 میکرولیتر Template، u/A 5/1Taq DNA polymerase صورت گرفت و به دستگاه ترمالسایکلر برنامههایی مطابق با جدول (3-2)، داده شد.
جدول(3-1).شرایطPCR
PCR condition

Author: مدیر سایت