پایان نامه درباره تمایز محصول و پیچیدگی

Acrylic color paints are in the water

Widget not in any sidebars
شکل ‏3 6 : نمایش کاربرد منحنی ذوب جهت تشخیص و تمایز محصولات اختصاصی و غیر اختصاصی واکنش PCR
آماده سازی پرایمر ها
به هر یک از پرایمر های لیوفلیزه جهت حصول غلظت pmol/µl 100 به میزان تعیین شده توسط شرکت سازنده آب مقطر استریل اضافه شد. سپس دلیل بالا بودن تعداد نمونه ها و واکنش ها برای جلوگیری از آلودگی و از دست رفتن استوک اصلی، پرایمرها در چندین تیوب در حجم های کوچک توزیع و تقسیم شدند. جهت تهیه پرایمر ها با غلظت pmol/µl 5 مخلوط حاصل به نسبت 1 به 20 با آب مقطر استریل رقیق شد.
تنظیم دما، زمان و غلظت پرایمر ها
شرایط انجام واکنش از قبیل دمای مرحله اتصال و هیبریداسیون پرایمر ها با رشته الگو، زمان مرحله گسترش و غلظت پرایمر های مورد استفاده, در بازده و میزان اختصاصیت واکنشRealtime RT-PCR تاثیر بسزایی دارد. لذا جهت تعیین دمای بهینه مرحله اتصال، زمان مرحله گسترش و غلظت مناسب پرایمرها به منظور دستیابی به شرایط بهینه واکنش از رده سلولی سرطان رتینوبلاستوما Y79 از GAPDH به عنوان نمونه کنترل مثبت استفاده شد. با انجام واکنش های Realtime-PCR در یک شیب دمایی، زمانی و غلظت پرایمرها با استفاده از نمونه کنترل مثبت مذکور و بررسی نتایج حاصل از انجام واکنشها دمای اتصال، زمان گسترش و غلظت پرایمر بهینه تعیین شد که در جدول ‏38 و جدول ‏39 ذکر شدهاند.
انجام واکنشRealtime RT-PCR
به منظور بررسی کمی بیان ژن های مورد مطالعه پس از سنتز نمونه هایcDNA توسط آنزیم رونوشت بردار معکوس و بررسی کیفی آن ها با استفاده از RT-PCR ژن خانه دار GAPDH ، واکنش Realtime RT-PCR با استفاده از سایبرگرین و مخلوط آماده واکنش Realtime RT-PCR ساخت شرکت تاکارا انجام شد. لازم به ذکر است که در بررسی هر نمونه برای هر یک از ژن ها 3 بار تکرار در نظر گرفته شد و واکنش به صورت سه تایی انجام شد.
مواد و وسایل لازم :
SYBR Premix Ex Taq II
پرایمرهای پیشرو و پیرو مربوط به هر یک از ژن های مورد بررسی
آب مقطر استریل
الگویcDNA
تیوب های 2/0 به شکل استریپ های هشت گانه و سرپوش های آن ها
مراحل کار :
به علت پیچیدگی انجام واکنش و تعداد زیاد نمونه های مورد بررسی به منظور جلوگیری از هر گونه خطا در انجام واکنش، ابتدا مشخص شد که در هریک از تیوب های هشت گانه کدامیک از نمونه ها و ژن ها تکثیر و بررسی خواهد شد و سپس این طرح با حروف اختصاری برای هر ژن و هر نمونه در دستگاه ثبت و ذخیره شد به نحوی که درنهایت یک طرح از چاهک ها که نشان دهنده ماهیت نمونه و نوع ژن مورد بررسی در هر یک از چاهک ها بود توسط دستگاه ارائه شد.
به دلیل انجام این واکنش به طور همزمان برای انواع مختلف نمونه و ژن، جهت کاهش احتمال خطا در ریختن مواد برای هریک از ژن های مورد بررسی یک مخلوطی از مواد موجود در جدول ‏38 به استثنای نمونه cDNA با توجه به تعداد واکنش های مربوط به آن ژن تهیه شد و در حجم 19 میکرولیتر طبق طرح داده شده به دستگاه در تیوب های مربوطه ریخته شد.
سپس 1 میکرولیتر از نمونه cDNA مربوط به هر یک از چاهک ها به آن ها اضافه شد.
تیوب های واکنش طبق طرح در دستگاه قرار داده شدند و برنامه زمانی و دمایی داده شده به دستگاه (طبق جدول ‏39 ) اجرا شد.
در نهایت به منظور اطمینان از صحت واکنش و اختصاصی بودن واکنش Realtime RT-PCR برای ژن های مورد نظر از دو روش زیر استفاده شد :
در انتهای واکنش منحنی ذوب محصولات از دمای 55 تا 95 درجه سانتی گراد رسم شد و وجود یک نقطه اوج اختصاصی در منحنی مورد بررسی قرار گرفت. Tm قطعات حاصل از تکثیر ژن های GAPDHو TGIFLX به ترتیب 5/82 و 82 درجه سانتیگراد میباشد.
الکتروفورز محصولات حاصل از PCRبر روی ژل آگارز 2% انجام گرفت.
جدول ‏3 8 : مواد لازم به ازای هر واکنش Realtime RT-PCR
نوع ماده حجم مصرفی (میکرولیتر)
SYBR Premix Ex Taq II 10